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利用Red重组系统敲除家蚕核型多角体病毒的vlf-1基因及对病毒复制的影响
【期刊年份】2013年第02期
【作者姓名】杜超逸 于威 全滟平 陈健 聂作明 吕正兵 张耀洲
【作者单位】浙江理工大学生物化学研究所；浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室
【作者姓名】杜超逸 于威 全滟平 陈健 聂作明 吕正兵 张耀洲
【作者单位】浙江理工大学生物化学研究所；浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室
摘 要 利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在E. coli DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1，调查对病毒复制的影响，以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从E. coli BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46，将其转化到E. coli DH10Bac中，获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株；再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物，5′端长40 bp，分别为vlf-1基因的左右同源臂，3′端长20 bp，分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列；以含有cat的pKD3质粒为模板，PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因，即打靶线性化片段；将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株，在Red重组酶的作用下，线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功，获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞，利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响，结果表明：vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响，但是可能影响之后的病毒装配和侵染。
关键词 家蚕核型多角体病毒； vlf-1基因； Red重组系统；病毒复制